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食品病原菌浓缩技术

RawMincedMeatinLab

重点:从食品基质中分离和浓缩微生物

更新日期:2019年11月1日

要点

  • 均质仪器和过滤的改进缩短了检测病原体所需的富集时间。
  • 国际标准方案现在包括对高危病原体的免疫磁分离。
  • 可行PCR技术可为HACCP监测提供实时病原检测结果。

食品微生物实验室承担的最重要的任务之一是检测样品中是否存在食源性病原体和潜在的腐败微生物。适用于食品的微生物标准和标准往往表明,诸如沙门氏菌大肠杆菌O157,以及单核细胞增多性李斯特氏菌在规定重量的样品(通常为25g)中应不存在。因此,这些方法必须能够检测25克食物样本中目标物种的单个活细胞。传统的基于培养的方法具有这种能力,但需要几天才能产生结果,因为需要将少量细胞扩增到培养中可以检测到的水平。

几十年来,减少完成病原体检测测试所需的时间一直是食品微生物学家的主要目标,其结果是许多研究都在开发快速方法。现在实验室有了一系列基于PCR和酶免疫分析等技术的检测方法,这些方法可以大大缩短测试时间,而且基本上是自动化的。

食物基质的复杂性进一步加剧了这一挑战。大多数食物由许多不同的材料组成,包括大的蛋白质、脂肪和油、糖和复杂的多糖,通常排列在一个复杂的三维结构。许多还含有一系列其他非致病性微生物,有时数量很高,但不会对消费者的健康构成威胁。目标病原体细胞可能是整个微生物群中的一个微小部分,以单个细胞或细胞团的形式附着在食物基质中。在快速检测方法能够成功使用之前,通常需要将目标细胞从食物基质和背景菌群中分离出来。一旦细胞被分离,如果它们可以被浓缩以更快的检测速度,就可以进一步节省时间。

方法

注意:在尝试分离和浓缩之前,样品必须悬浮在相对较大体积的液体中——稀释剂或生长介质。几乎所有目前的病原体检测方法都包括富集培养或悬浮步骤。

富集培养

最近的进展:根据感兴趣的病原体,ISO和BAM(美国,FDA)标准可能因协议中使用的培养基而不同,但它们的浓缩时间很少有差异。一些快速的方法将浓缩时间缩短了一半,尚未纳入ISO和BAM标准。快速方法的供应商及其潜在用户必须通过适当的认证机构对这些方法进行验证。

例如,病原体大肠杆菌0157在ISO和BAM协议中,标准浓缩时间均为18小时。但随着最近过滤和浓缩技术的进步,食品微生物学家现在可以在8小时内完成整个检测方案。

国际标准:目前,传统方法仍然适用于检测食品样本中少量病原体的国际标准。许多标准方法包括两阶段富集培养。第一步,即预富集,涉及将所需样品重量(10-25g)悬浮在大体积(100-250ml)非选择性培养基中,该培养基旨在复苏受损细胞并促进微生物生长。通常在37℃下培养18-24小时后,将少量培养物转移到适当的选择性富集培养基中,该培养基旨在抑制竞争生物体的生长,同时允许目标病原体繁殖。理论上,这种方法可以将单个活细胞放大到可检测的水平,即使它仍然附着在食物基质上。无需处理样品以确保微生物细胞自由悬浮在培养基中。虽然简单可靠,但传统的基于培养基的富集方法非常耗时,通常需要几天才能完成。

食品样品悬浮液

不使用某种形式的富集培养的病原体检测方法仍然需要在分离、浓缩前制备样品悬浮液,并且可以应用检测技术。理想情况下,初始悬浮液的制备方法是使每个靶细胞在稀释剂中自由悬浮。大多数食物都需要使用胃机或搅拌器进行均质。测量A时不应使用搅拌机w因为它们能产生热量,使食物中的水蒸发,从而影响Aw读数。

传统的定量方法(如总活菌数)通常指定某种形式的机械搅拌,以从样品基质中释放微生物细胞。一些协议仍然包括旋转叶片搅拌机作为生产悬浮液的首选方法,但需要清洗和消毒样品之间的搅拌器和悬浮液产生的热量问题限制了它们的有效性。桨式搅拌机,如Seward Stomacher®克服了这些问题,处理样品在一个无菌塑料袋,使桨不接触样品,并保持清洁。它们还能处理大量的液体。桨式搅拌机现已广泛应用于食品微生物实验室,并已取代桨式搅拌机。

来自Microgen Bioproducts的Pulsifier®是最近的发展,它用高速振荡环取代了桨片,产生冲击波和搅拌。Pulsifier可以释放更多的微生物细胞到悬浮液中,比其他搅拌器对食物基质的破坏更少,而且不会在悬浮液中产生大量的食物残渣。其他制备初始悬浮液的方法,如超声波处理,已经进行了研究,但应用不广泛。

分离和浓度

需要注意的是:一旦微生物细胞从食物基质中释放到悬浮液中,就可以分离目标病原体,并将细胞浓缩以便更快地检测。许多不同的物理、化学和免疫学方法已经被设计来完成这一任务,包括离子交换柱和双相分配。但有三种技术构成了最实际应用的基础:膜过滤、离心和免疫磁分离(IMS)。

1.膜过滤

过滤作为一种从样品悬浮液中分离和浓缩微生物细胞的方法具有明显的吸引力。它相对便宜和直接,具有快速处理大量悬浮液的潜力。市场上的一些过滤产品可以在食品被均质时工作。这通常被称为预过滤步骤,允许更高级的过滤膜更有效地工作。例如,InnovaPrep浓缩吸管将自动使稀释剂通过微生物附着的过滤膜。该洗脱液使用专有的湿泡沫技术生产,现在可以在PCR热循环仪上进行裂解和运行,以满足病原体DNA检测的要求。整个过程,包括浓缩阶段,只需要8个小时。

过滤高脂肪加工食品时会遇到困难。食物残渣会堵塞细胞膜,阻止一些靶细胞被收集。通过胰蛋白酶消化或添加表面活性剂等技术可以改善食品悬浮液的可过滤性,但这也可能干扰病原体检测并降低细胞活力。

对于可过滤的样品,如饮料和一些乳制品,基于膜过滤的实用分离和浓缩方法已经开发出来,并与各种微生物检测技术相结合,作为商业可用的仪器和测试系统。例如BioMeriux公司的ScanRDI,它使用固相细胞检测技术直接在过滤器上检测活细胞。以显微镜为基础的方法,如直接表观荧光过滤技术(DEFT),也仍被一些实验室用于计数膜过滤器上的细菌细胞。

2.离心分离

离心法也被成功地用于分离和浓缩食品悬浮液中的微生物细胞,尽管其应用受到处理大量液体的实际考虑的限制。低速离心可以用来去除食物残渣,同时使细菌细胞悬浮,然后用更高的速度来浓缩细菌。或者,可以使用基于密度梯度离心的方法。例如,浮力密度离心(BDC)已用于快速检测食源性病原体。它通过浮选和沉淀分离具有不同浮力密度的细菌细胞和食物颗粒,并去除PCR抑制剂。还开发了一些商业应用程序,特别是自动Foss Bactoscan™ 专为乳品行业设计的FC仪器。这可以在流式细胞仪检测和计数之前,借助密度梯度从牛奶中分离细菌细胞。

3.Immunomagnetic分离(IMS)

IMS技术最早开发于20世纪80年代,目前广泛应用于食品微生物学中,用于从其他微生物中分离目标病原体。将磁化的聚苯乙烯珠子或其他颗粒涂上针对目标生物的特异性抗体,然后将这些抗体直接添加到一定体积的样品中(可能是高计数的),或者更经常地添加到预富集培养中。经过短暂的孵育后,目标细胞被固定在小球的表面,并可以利用强大的磁场浓缩成一个小球。然后样品可以被丢弃,颗粒被重新悬浮并清洗以去除食物残渣和其他物质。固定化的病原体可以通过培养或PCR、ELISA等快速方法检测。IMS是一种非常有效的分离和浓缩技术,尽管它不适合处理大量的样品或培养物,部分原因是需要高浓度的珠粒来结合目标细胞。

用于食品微生物学应用的磁珠和微粒已上市多年。最著名的是Dynabeads®,由ThermoFisher Scientific提供,设计用于从预富集培养中选择性捕获和浓缩一系列食源性病原体。Dynabeads特定于沙门氏菌李斯特菌以及几种VTEC血清型。Dynabeads还可以在使用beadretriver™系统的自动化过程中使用。自动化IMS技术的进一步发展可以通过同样来自赛默飞雪的Pathatrix®自动系统来说明。Pathatrix的独特之处在于允许最多10个样品在预富集后合并,通过减少检测测试提供了相当大的成本节约。分离浓缩过程可在15分钟内完成。

未来的发展

虽然现有旨在加快从食品中分离和浓缩微生物过程的方法和仪器,但仍需要开发新的方法来支持聚合酶链反应和基于免疫学的检测试验。目前,食品微生物学家仍然依赖富集培养将少量的病原体扩增到可检测的水平,即时检测的目标尚未实现。

摆脱对浓缩程序的依赖的一种方法是将上述的一些技术以多步骤方法结合起来。例如,一个协议使用过滤,低和高速离心和浮密度梯度离心的组合已经被描述。在食品样品中可以检测到250倍浓度的目标病原体,检测出10 CFU/g沙门氏菌结合PCR检测技术,在3小时内对鸡进行检测。这种方法不适合食品微生物实验室的常规应用,但确实表明了多步骤方法的发展潜力,特别是如果它们可以自动化。

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