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药品和医疗器械内毒素检测方法

MAT与内毒素检测的区别

介绍

内毒素细菌内毒素是制药和医疗器械行业安全与质量的关键问题。它的重要性在于它是热原性的。热原是一组不同的化合物,定义它们的能力是,当它们被引入血液时,会导致核心温度迅速上升(“Pyro”来自希腊语,意为“火”)。这可能会导致迅速的炎症反应和严重的休克,在某些情况下还会导致器官衰竭和最终死亡。明确致热源的存在在任何注射药物制剂或医疗设备的表面,接触血液或脑脊液是一个潜在的危险和重要的是能够测试各种产品的这些化合物的存在。细菌内毒素是目前最普遍的热原,也是生产环境中最容易发现的热原,因此检测方法是重点。

细菌内毒素实际上是脂多糖(LPS)的同义词,脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁外层的主要成分。革兰氏阴性菌的细胞壁比革兰氏阳性菌的细胞壁更为复杂,其外膜或外膜由LPS构成。这作为细胞的渗透屏障,在生物膜的形成和从周围环境捕获大分子方面也很重要。在革兰氏阴性菌败血症中,热原LPS的释放导致大量炎症细胞因子的释放,可能导致中毒性休克。革兰氏阴性细菌不断合成脂多糖以补充细胞表面失去的脂多糖,当细胞死亡时,它们从细胞壁释放脂多糖。这意味着游离LPS将始终存在于含有革兰氏阴性菌的环境中。相反,革兰氏阳性细菌不释放细胞外脂多糖。因此,控制革兰氏阴性菌在水中、其他原料和生产环境中的生长是很重要的,以防止热原的产生。然而,革兰氏阴性菌的缺失并不意味着热原的缺失。LPS是一种非常稳定的材料,不容易被加热或其他方式破坏。 It can persist for very long periods in liquids and on dry surfaces in the absence of viable bacteria. This means that tests specifically designed to detect endotoxin/LPS are essential to demonstrate the safety of pharmaceutical and medical device products.

检测方法

第一个广泛用于检测药品内毒素的方法是兔热原试验,最初描述于1925年。这种方法包括给兔子注射试验液,然后监测它们的体温是否升高和发烧症状。家兔热原试验既费时又昂贵,而且不能进行定量。它的应用也仅限于不会对实验动物造成不良影响的产品。该试验仍被认可为一种检测热原的方法,但现在很少使用,已经被鲎试剂或LAL试验很大程度上取代。

拉尔测试

LAL的检测起源于20世纪50年代的一项发现,即大西洋马蹄蟹(灰度变聚物)在细菌内毒素存在时形成血块。后来发现,这种反应是由一种凝血因子引起的,这种凝血因子包含在运动血细胞颗粒中,称为变形虫细胞。当内毒素被检测到作为一种感染防御时,凝血因子被释放到细胞外的血液中。即使细菌内毒素水平很低,也会引发涉及一系列丝氨酸蛋白酶的“凝血级联”反应,并导致凝血凝胶凝块。这种反应已经发展成为一种灵敏的内毒素检测方法,方法是从马蹄蟹的血液中采集阿米巴细胞,然后溶解这些细胞,产生一种含有凝血因子的试剂——鲎阿米巴细胞裂解液。

发展了凝胶凝块法、显色法和浊度法三种基本的LAL方法。凝胶凝块技术可以形成一个非常简单的检测方法的基础,将试剂添加到试管中的样品中,并在37℃孵育oc一小时。如果在管的反转上显而易见,结果是阳性的。它是一种端点方法,可以通过测试串行稀释液进行半定量。结果表达为内毒素单位(EU),是内毒素效力的衡量标准而不是数量。这反映了天然存在的LPS的毒性变异性。色原法采用合成基质,当通过内毒素活化的蛋白酶切割时,产生颜色变化,而浊度方法依赖于改变样品浊度的显影凝血酶凝胶凝块。两者都可以通过绘制起始毒素浓度的标准曲线来用作定量动力学方法。分光光度仪器可以比形成可见凝胶凝块所需的内毒素浓度的浊度或颜色的变化检测到浊度或颜色的变化,使发色和浊度方法比凝胶凝胶法更敏感。灵敏度由标准曲线上的最低浓度确定。

LAL测试现在是非肠道药物和医疗器械内毒素测试的标准方法,并在美国、欧洲和日本药典(USP第85章,EP 2.6.14补充6.6和JP通用测试4.01)中指定为协调方法。这三种方法中的任何一种都可以使用,但在出现任何争议时,参考方法是凝胶凝块限度试验。美国食品药品监督管理局也在2012年为制药和医疗器械行业发布了内毒素和热原检测的详细指南。这包括关于抽样计划、样品储存、替代内毒素检测的验证和质量按设计(QBD)计划中定量检测的首选使用的信息。在进行内毒素检测时,有几个要点需要考虑。一是确保在试验中使用无热原的实验室设备和试剂,以避免假阳性。医疗器械的测试通常是用标准体积的水或适当的稀释剂冲洗表面,这也必须是无热原的。许多因素可能会干扰试验,无论是通过影响内毒素或LAL试剂。例如pH值、蛋白质浓度和非肠道药物或漂洗中存在的干扰化学物质。干扰可能导致内毒素检测失败,因此识别内毒素非常重要。 This is best done through the use of positive control samples spiked with a suitable reference standard endotoxin or a certified standard.

有许多基于LAL方法的商业测试产品,它们关注于便利性和易用性。凝胶凝块、显色和浊度测试的试剂都是可用的,通常针对特定的方法进行优化,并以冻干形式提供,底物和缓冲液可在使用前重新组合。试剂的数量可用于单个测试,也可用于多个测试,或用于实验室处理大量样品的批量。简单的凝胶凝块测试可以用最少的设备进行,而动力学测试至少需要分光光度计。许多商业试剂现在设计用于微孔板格式。通过使用装有内毒素检测软件的孵育板阅读器,如Charles River公司的Endoscan-V™,可以实现一定程度的自动化。

内毒素检测失败的常见原因及避免方法

快速拉尔方法

与其他微生物检测相比,内毒素检测减少完成检测所需的时间不是一个问题,因为标准方法只需要一个多小时即可完成。尽管如此,已经开发出了快速测试方法,并可在商业上使用。其中一个例子是Charles River Endosafe®-PTS™系统,该系统基于动力学显色方法,在四通道药盒中预先装载精确数量的LAL试剂、显色底物和控制内毒素。将墨盒置于手持阅读器中,然后将样品一端添加到四个孔中,然后通过包含试剂的通道绘制。大约15分钟就可以得到结果,该系统是为使用点测试设计的。使用相同技术的多管式Endosafe®-MCS系统也可用于在实验室环境中测试多个样品,而Endosafe®Nexus™是一种全自动、自动化的系统,适用于大容量水测试。高地生物科学公司采用了不同的方法,开发了PyroXpress™系统。这也使用墨盒,它可以预先装载试剂或接受用户提供的试剂。它基于简单、低成本的凝胶凝块方法,并在读取单元中采用“多光束谐振器”技术,可以在5分钟内产生结果,还能提供动力学数据。

拉尔的替代品

虽然LAL检测仍然是内毒素检测的标准方法,但人们对该方法的某些方面的担忧推动了替代方法的发展。例如,商业批次的裂解液对内毒素的敏感性和特异性各不相同。但一个潜在的更大问题是马蹄蟹供应的减少。虽然采集这些动物的血液不会伤害它们,但其他环境压力正导致野生动物种群濒临灭绝。不需要为LAL的生产采集它们的血液,肯定有助于它们的保护。通过减少进行化验所需的LAL试剂的数量,已经取得了很大的成就,但这种方法仍然依赖于蟹类的充足供应,最终可能无法持续。

解决这一问题的一种方法是开发使用重组因子C (rFC)的检测方法,这是一种内毒素敏感蛋白,在LAL试验2021欧洲杯德国vs意大利竞猜中作为凝血级联反应的引物。先进的基因工程已经使高灵敏度rFC的生产成为可能,它可以作为一种不依赖马蹄蟹的内毒素检测方法的基础。这已经开发成商业测试产品,特别是龙沙提供的PyroGene™系统。热基因是一种基于rFC的终点检测方法,rFC由内毒素激活,然后裂解合成底物释放出一种荧源化合物。它以微孔板形式运行,需要一个小时才能产生定量结果。据说它比传统的LAL检测更具特异性,而且不受葡聚糖假阳性的影响,而葡聚糖假阳性是LAL检测中的一个问题。FDA已经批准了基于rFC的内毒素检测用于最终产品的放行,前提是它与参考凝胶凝块限度检测相对照。

另一种替代方法是单核细胞激活测试(MAT),它利用人类血液中的免疫反应。该测试利用被热原激活的单核细胞产生炎症细胞因子白细胞介素-1ß (IL-1ß),然后可以通过ELISA检测。该方法对细菌内毒素没有特异性,但也可以检测其他热原,并被EP批准为一种在体外可替代家兔热原试验。据说它比LAL测试更能反映人类对热源的发热反应,因为它是基于人类免疫反应的。MAT测试已经发展成商业产品,如默克密理波公司提供的PyroDetect系统。

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