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大肠杆菌VTEC / STEC检测和食品隔离

肉类安全工具,服务和支持

要点

  • VTEC O157血清组是最重要的,但其他血清组,如O26和O145,也不应被忽视。2011年德国的一次大爆发是由O104引起的
  • 传统的方法可能需要五天才能产生结果。
  • 大量节省时间的快速方法在商业上可用,提供24小时内的结果。
  • 非o157 VTEC的检测方法尚未广泛应用。

VTECsalads

革兰氏阴性非芽孢细菌大肠杆菌属于肠杆菌科,也是大肠菌群的一员。

该物种是人类和动物正常肠道菌群的一部分,它在食物和水中的存在通常被解释为粪便污染的标志。大多数大肠杆菌菌株是非致病性的,但有些确实会导致肠胃炎或更严重的感染。

特别是一组非常关注食品微生物学家。该螺旋细胞毒素生产大肠杆菌(VTEC)小组之所以这样称呼,是因为其成员产生的毒素对一种名为vero细胞的培养细胞系具有细胞毒性。

该VTEC组有时也被称为志贺样毒素的大肠杆菌尤其是在美国。一些VTEC菌株能够导致严重的食源性感染,如人类出血性结肠炎。这些致病性菌株通常称为肠出血性菌株大肠杆菌(肠出血性大肠杆菌)。

对VTEC分离株的血清学分析确定了100多个血清组,但已知其中只有少数具有导致人类严重感染所需的肠出血性大肠杆菌毒力因子。

致病性VTEC菌株似乎具有非常低的感染剂量,这可能是因为它们对酸性条件具有相对的抵抗力,而且只有10个细胞就可能致病。症状各不相同,许多健康成年人只患轻微腹泻或无症状。然而,易受感染的人,特别是五岁以下儿童和老年人,更有可能发展成严重的感染,并出现血性腹泻、腹痛、呕吐和长达10天的发烧。但在少数情况下,这种感染可能会导致溶血性尿毒综合征(溶血性尿毒综合征),这可能导致肾衰竭,有时在幼儿中是致命的。约三分之一被诊断为VTEC感染的人需要住院治疗。低感染剂量和潜在的严重感染是食品VTEC污染如此严重的主要原因。

大肠杆菌O157食品中最重要的肠出血性大肠杆菌血清型为O157,食源性感染中最常见的血清型为O157:H7。大肠杆菌O157:H7已经在一些国家,包括美国,英国和其他欧洲国家造成了重大食源性疾病暴发。这些爆发通常与煮熟的碎牛肉产品,如汉堡包,用未经消毒的奶类产品相关,但在美国爆发也与新鲜农产品,特别是袋装新鲜菠菜。牛是病原体的主要水库,但它们的粪便也可用于灌溉污染水道。

一个重要特征大肠杆菌O157:H7是指其在44-45°C下生长不良,这可能意味着其无法通过传统的测试检测到大肠杆菌在食物。它还具有异常的耐酸性,有报道称它能在pH值低至4.0-4.4的环境下生长,并能在pH值为3.6的酸性食物中生存。幸运的是,它不耐热,在烹饪过程中会被破坏。在英国,建议汉堡在内部温度至少70摄氏度的情况下烹饪2分钟,以消灭病原体。

非O157 VTEC非O157 VTEC菌株有时被忽视为食源性疾病的病因,但在与食品相关的疫情中,已确定了其他血清群,最显著的是O26、O103、O111和O145。例如,2011年在德国和法国发生的一场影响至少3900人的疫情是由O104血清型菌株引起的。这次大爆发与埃及的胡芦巴种子发芽有关,导致48人死亡。2013年在美国发生的一起与冷冻食品相关的疫情是由来自美国的一种菌株引起的大肠杆菌O121血清组。

相对而言,对非O157 VTEC所知甚少,但它们似乎与O157血清组有许多共同特征。牛可能也是非o157 VTEC的主要宿主,但其他动物,特别是反刍动物,也可能作为宿主。

样品的储存和制备

检测是否含有VTEC的食品样本大部分是生肉,特别是牛肉,或未经巴氏消毒的奶制品。对其他种类的食品进行这些病原体的常规检测是不寻常的。

用于检测VTEC的样品应在收集后冷藏并尽快进行检测。除非没有其他方法,否则样品不应冷冻,尽管VTEC细胞在低温下存活得很好,仍有可能被检测。

样品制备通常需要在适当的浓缩肉汤或稀释剂中均质。

检测和分离:基于培养的方法

O157 VTEC目前有一种检测食品和饲料中VTEC O157的ISO水平方法。ISO 16654:2001推荐用于欧盟和其他地方的食品和饲料监测,并于2012年得到审查和确认。FDA细菌学分析手册(BAM)包括了一种类似的方法,尽管实时PCR检测现在是首选。

对于ISO 16654方法,第一阶段是在添加了20mg/l抗菌新生素的改良胰蛋白胨大豆肉汤中进行富集培养。通常25g样品用225ml富集培养基均质,在41.5°C孵育6小时。

免疫磁分离(IMS)程序在6小时和12-18小时使用商业磁珠进行,磁珠上涂有VTEC O157特异性抗体。珠子被镀在两种选择琼脂培养基上。其中一个必须是添加头孢克肟和碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂(CT-SMAC)。这种培养基利用了VTEC O157无法在24小时内发酵山梨醇,从而将菌落与其他大肠杆菌区分开来。第二选择琼脂可从一系列市售显色可用培养基中选择。平板在37℃下培养18-24小时,检查典型的VTEC O157菌落。

从每种培养基中提取最多五个典型菌落,然后在非选择性琼脂培养基上进行传代培养,并检测吲哚的形成,以确定分离株是大肠杆菌. 可以使用玻片凝集试验从血清学上对VTEC O157进行推定确认,但致病性VTEC O157的最终鉴定和分型应在参考实验室进行。这需要使用PCR方法检测推定阳性菌株,以检测毒素产生所需的基因(eae和vtx)。

Non-O157目前对于非O157 VTEC没有标准的基于培养的方法。琼脂培养基缺乏大多数非0157 VTEC菌株会发酵山梨醇和商业选择。然而,一些媒体选择性其他血清群VTEC已经开发了诸如用于VTEC O26经修饰的CT-SMAC介质,其中鼠李糖代替山梨糖醇,和生色O26平台。在ISO 16654的方法也已适于通过使用涂有特异性的抗体的其他重要血清群和改良的选择性琼脂IMS珠。近日,从公布的选择性显色培养基的细节用于检测六个非O157 STEC血清型农业的美国农业部(USDA)的研究人员(O26,O45,O103,O111,O121和O145)现在必须常规筛查为在美国肉类样品英寸

检测和分离:快速方法

O157对食品中O157-VTEC污染的关注导致了许多快速检测和分离方法的发展,其中许多现在作为商业测试试剂盒和系统提供。大多数产品针对肉类行业,用于测试磨碎牛肉和类似产品,但也可用于怀疑O157 VTEC污染的其他食品。

Immunoassay-based方法许多现有的商业产品都是基于免疫技术。结果如下18-24小时富集步骤是在20-26小时提供服务。全自动免疫分析系统也可提供。

在该方法中加入免疫浓缩步骤可以减少潜伏期并提高灵敏度。浓缩后的样品可以用免疫分析法或其他检测方法进行检测。

一些制造商已经开发了免疫分析技术,以生产非常简单使用的免疫色谱横向流动分析。这些通常与浓缩肉汤一起提供,通常声称在浓缩步骤仅8小时后的10-15分钟内提供清晰的视觉存在或不存在结果,尽管ISO 16654中描述的标准20-24浓缩也可以使用。

基于分子生物学的方法(PCR)其中许多商业测试试剂盒和系统检测使用PCR技术O157 VTEC的显著数量已经在过去15年已经启动,包括实时检测。使用专用的媒体和/或IMS初步富集步骤可以减少到只有6-8小时。PCR测定的结果则进一步在四个小时内可用。

确认虽然快速乳胶agglutination-基于确认试验,如RemelWellcolex®测试,可用于O157 VTEC,最终确认应该还是可以通过参考实验室如上完成。

Non-O157

目前有一种ISO水平检测STEC和O157、O111、O26、O103和O145血清组的方法。ISO/TS 13136:2012是基于实时PCR为基础的筛选方法,该stx运算单元毒力基因。当一个或两个基因都检测到,则STEC应变本应尽可能确认分离。该BAM PCR方法也能检测一些非O157 STEC。

目前,专门用于检测食品样品中非o157 VTEC的检测试剂盒还没有广泛使用。然而,目前在美国已经有几个以pcr为基础的试剂盒,用于检测美国农业部肉类产品中的“六大”血清群。这些包括Pall公司的GeneDisc®-食品病原体检测系统,以及Instantlabs公司的Hunter®系统。此外,在2011年德国爆发疫情之后,Biotecon开发了一种用于血清组O104的食品防®检测试剂盒。

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