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水处理、临床和食品中隐孢子虫/贾第鞭毛虫的检测和鉴定方法

微小隐孢子虫卵囊释放子孢子

测试方法指南末尾提供的产品供应商列表(带有产品页面链接)。

要点

  • 微小隐孢子虫和肠道贾第鞭毛虫是通过水和食物传播的肠道寄生虫,在发达国家对人类健康构成威胁
  • 临床和水样的标准检测方法基于显微镜,需要熟练的技术人员正确执行。
  • 诊断和免疫测试通常用于水处理。
  • 水工业的检测方法需要巨大的样本体积和有效的浓度程序来检测可能存在的最低数量的原生动物囊肿
  • 新的免疫学和基于pcr的检测方法比显微镜更灵敏、更快、更容易,并提供了物种和基因型的区分的可能性(临床)

导言:广泛的肠道寄生虫可直接或通过受污染的水和食物传播给人类。一般来说,这些生物体在卫生条件差的发展中国家更为普遍,但在发达国家,有些生物体对公共卫生构成重大威胁。最重要和最广泛的肠道寄生虫是原生动物。原生动物是微小的单细胞生物,其中一些是包括人类在内的动物的寄生虫。有几个属能够引起水媒和食源性疾病,但发达国家最重要的两个属是隐孢子虫贾迪亚. 这些原生动物的检测和鉴定方法已经开发出来,用于临床、水和食品微生物学实验室。

虽然有很多隐孢子虫和贾第虫属种(18隐孢子虫水测试实验室和临床环境中使用的方法属于属水平,因此寄生虫的确切种类及其来源尚不清楚(或当时不需要)。

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表1。关于感染人类最流行寄生虫的形态和感染性的重要信息。

方法

原生动物寄生虫感染性包囊的检测无法通过培养技术完成,而取决于是否有足够的包囊存在,以便通过显微镜、免疫学或分子方法进行检测。空气污染的检测方法隐孢子虫卵囊,贾迪亚囊肿非常相似,通常可以使用相同的分析同时进行。大多数已出版和商业化的检测方法都是为临床和水应用而开发的,但也有检测某些食品中寄生虫的方法。

1.水和环境方法

国际标准议定书:ISO 15553:2006“水中隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫囊肿的水质分离和鉴定”是唯一适用于这些寄生虫水质检测的ISO方法。

然而,英国公共机构,分析师常务委员会(SCA),发布一套标准议定书,通常称为“蓝色书籍”,是英国群岛的水测试中的金标准。该协议定期更新,自去年已在网上免费提供。作为该系列的一部分,书籍“水的微生物质量”,第14部分 - 在这些寄生虫上有一个部分;标题为“隔离,识别和枚举的方法”隐孢子虫卵囊,贾迪亚囊肿”。本文档有广泛的细节,并辅之以两种寄生虫的大量显微图像,应用不同的染色和对比技术。我们总结了该文件和美国环保局1623方法中的要点。

过滤隔离:隐孢子虫和贾第鞭毛虫囊肿的数量通常很低,这阻碍了对处理过的饮用水、原水和废水样品的监测。这意味着需要对大量的水进行检测,特别是在检测处理过的水时。因此,浓缩步骤是必不可少的,目前的方法包括在检测方法之前的过滤步骤。

可内置水处理厂样品的收集和储存,以便在处理过程的不同阶段将大量水(处理水高达1000升)直接通过合适的过滤器转移。然后将过滤器送至实验室,在制冷条件下进行进一步分析,并尽快进行处理。但是,如果需要进行远程测试,则可将水收集在大型容器(10-50升)中,并运输至实验室,冷却至10℃以下。样品处理应在取样后96小时内开始。

检测:水样首先通过过滤系统,能够捕获小型密码孢子虫和贾纳迪亚囊肿。专门为目的设计的过滤器胶囊可商购获得,并且示例包括来自Pall Life Sciences的Envirochek™胶囊和IDEXX的FILTA-MAX®系统。然后洗脱过滤器,然后将洗脱液离心以浓缩囊肿,然后使用免疫磁性分离(IMS)程序将其与其他材料分离。IMS程序可以使用TCS BiosciencesIsolate®系统半自动。然后使用标记的单克隆抗体溶液染色卵囊和囊肿,并通过免疫荧光测定(FA)显微镜检查。通过用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和通过差异干扰对比(DIC)显微镜,可以通过染色确认。用于FA显微镜的染色系统可商购获得,包括Meridian Biosciences Merifluor系统和生物点EasyStain™系统。EasyStain也被发现适用于PCR分析。(下载报告- Di Giovanni, g.d., r.m. Hoffman和g.d. Sturbaum, 2010。调节显微镜载玻片隐孢子虫基因分型方法,项目4099报告。丹佛:水资源研究基金会)

也开发了用于水中卵囊和水中的Giardia囊肿的分子生物学和基于PCR的检测方法。与临床方法一样,这些靶标在原生动物基因组上的特定序列,可以用作FA显微镜的替代品。有些商业产品可用,例如CeeramTools系列来自Biomérieux和Norgen Biotek市场隐孢子虫RT-PCR检测试剂盒,用于水和环境样品。

标识:不幸的是,水工业中使用的标准方法没有确定原生动物物种或基因型。

质量控制和参考资料:EasySeed™是Cryptimium和Giardia测试的全球参考标准。它由英国饮用水监察机构和美国环保局批准。ColorSeed™易于作为内部标准使用,可添加到隐孢子虫和贾第虫检测的每个样本中。灭活的隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫囊肿呈荧光红色,而样本中的隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫囊肿呈荧光绿色。

2.临床方法

隐孢子虫病和贾第鞭毛虫病的诊断可以通过十二指肠抽吸物的显微镜检查和子孢子和生命周期其他阶段的活检样本来完成。然而,粪便中大量卵囊的存在允许通过检查粪便样本进行检测,大多数临床方法都基于这种方法。

样本的收集和储存:粪便样本用于疾病诊断隐孢子虫贾迪亚应尽快测试感染,理想地在24小时内。或者,可以用福尔马林和其他固定剂冷冻或保存样品。由于囊肿的脱落可以是散摩的,因此应收集至少三个连续的样品。

检测感染者的粪便中可能存在大量的囊肿,新鲜样本无需进一步处理即可检查。然而,对于保存在固定剂中的样品,可能需要进行浓缩步骤。通常,这涉及福尔马林-乙酸乙酯浓缩程序和离心分离囊肿和碎片。

显微镜检查:从新鲜或浓缩样本制备的粪便涂片的直接显微镜检查仍然广泛用于检测粪便中的原生动物囊肿。就像我们的囊肿一样隐孢子虫,以及较小程度贾迪亚,需要染色程序来识别它们。已经开发了许多不同的染色技术,但抗酸程序,如Ziehl-Neelsen染色和改进Kinyoun染色,以及三色染色和基于荧光的染色,如金胺酚,是常用的。这些方法需要有经验的显微镜专家的技能来正确地执行和解释。

通过显微镜检测原生动物寄生虫囊肿的当前优选方法基于免疫学。直接荧光抗体(DFA)测试利用特异于细胞壁抗原的荧光标记的抗体贾迪亚囊肿,隐孢子虫卵囊以显示寄生虫并提供明确诊断。商业DFA测试是可用的,如广泛使用的MERIFLUOR®Cryptosporidium / Giardia.它比传统的染色技术更敏感,也更容易操作。

免疫学:还开发了一些基于免疫学的方法来检测粪便样品中可溶性原生动物抗原,从而去除对微观检查的需求。这些方法现在广泛用于临床实验室,用于在通过显微镜确认之前快速筛选大量样品。酶免疫测定(EIA)技术已被用于开发商业产品的检测隐孢子虫卵囊,贾迪亚囊肿。这些分析可以在几个小时内使用微孔板格式进行,并使用分光光度板读取器读取结果。示例包括Remel的ProSpecT®微孔板免疫分析和R-Biopharm的RIDASCREEN®免疫分析范围。

免疫层析横向流动“试纸”试验也已开发用于粪便样本中原生动物抗原检测。这些测试是敏感和具体的,但非常容易使用,并在10分钟内提供结果。商用横向流动测试的示例包括ImmunoCard STAT!®来自Meridian Biosciences的测试和Remel的Xpect®测试隐孢子虫

分子生物学:近年来,基于分子生物学的原生动物寄生虫诊断检测方法得到了发展。它们通常基于PCR或实时PCR(RT-PCR)技术和原生动物基因组中的目标特异序列。这些方法提供了高度特异性和敏感性的检测,但尚未发展成为广泛可用的商业临床诊断产品。然而,来自bioMérieux的CeeramTOOLS包括基于RT-PCR技术的分子检测检测试剂盒,该试剂盒在这两个领域都有销售隐孢子虫贾迪亚在临床样本和一些用于筛选兽医样本的PCR检测中已经可用。

标识:鉴定隐孢子虫贾迪亚对物种水平的研究是传统方法所面临的挑战,也是寄生虫学专业实验室的一项任务。在常规诊断目的中通常不需要,但在疫情调查中可能很重要。最近,分子生物学技术使鉴定更加实用,尽管仍然需要专业技能。PCR结合限制性片段长度多态性(RFLP)分析或测序,针对基因组的不同部分,已被广泛应用。还介绍了实时荧光定量PCR方法。例如,Invitrogen公司的隐孢子虫基因分型试剂盒可以区分感染和非感染物种和基因型。

3.食物的方法

食物样本很少被测试隐孢子虫卵囊或贾迪亚囊肿。可能存在的低数量和从大多数食物基质中提取它们的困难妨碍了实际的常规分析。然而,针对某些“高风险”食品,特别是即食沙拉和新鲜农产品,已经开发出了方法。FDA细菌学分析手册(BAM)包括这样一种检测方法隐孢子虫新鲜农产品中的卵囊可清洗和过滤样本,如果汁。所描述的方法是从水分析中使用的方法改编而来,包括显微镜和基于pcr的检测。

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