使用实时PCR检测SARS-COV-2具有高灵敏度和特异性的优势，使其成为Covid-19诊断的“金标准”。然而，它可以从几个特定目标的初始拷贝生产数百万份副本的能力带来了分子技术人员的头痛：污染问题。

主要原因污染PCR过程中：

• PCR扩增子气溶胶，阳性对照或阳性标本的产生和传播。
• 引入PCR的污染从手，衣服和头发混合。

这些污染问题可能会导致假阳性结果，而且，它是很难被减少或一旦发生删除。因此，预防污染起着PCR实验室的更为重要的作用。正确的实验室的设置和工作流程，以良好实验室规范（GLP），同时将大大有助于减少污染的可能性。

在这篇文章中，我们已经（Bioperfectus）总结了建立PCR实验室的一些技巧，其中包括基本的做法，以避免污染的程序。

PCR实验室装置

工作区域物理隔离

在诊断样品上进行PCR分析的实验室应分为至少三个物理上单独的房间（参见主要图像）

• 试剂准备区
• 样品制备区
• 放大和产品检测区域

试剂制备面积用于试剂等分试样和母体混合制剂。这个房间应该是最干净的所有空间用于准备PCR实验，理想情况下应在配备有UV光的指定的层流柜中。PCR试剂应保持在相同指定区域的冰箱（每个制造商的建议）中，理想情况下，在层流箱旁边。应在反应容器中制备和等分母组，并提取核酸和扩增的PCR产物禁止在这方面的处理。

样品制备面积用于核酸提取和DNA模板和对照添加。理想情况下，应在配备UV光的指定生物安全柜中添加样品。为避免分析提取的核酸样品的污染，建议首先添加样品和阴性对照，然后最后添加阳性对照或标准。样品应储存在同一区域的指定冰箱和冷冻机中，但PCR试剂和扩增产物禁止在这方面需吸移。

扩增和产品检测区域进行放大和扩增产物和产品分析（不适用于实时PCR）的处理。它通常包含的热循环仪和实时平台。理想情况下，层流柜将被用于需要PCR扩增后操纵开口管的任何步骤。

空气压力和空调：

• 试剂制备区域（使用正气压以防止引入污染）
• 样品制备面积（使用负压压力以保持房间中的模板核酸）
• 扩增和产品检测区域（使用负压使房间内的扩增核酸保持）
• 空气处理器的三个区域需要被连接到单独的空气管道，并且每个必须导致排气一个单独的位置。做不是为这三个区域使用中央空调系统和导管。

单向工作流
当PCR程序开始时，方向将是试剂制备区域→样品制备区域→PCR扩增区域。绝不先前处理的管返回到前述工作区域或房间。谁已经在PCR后运营商的工作不应该回去和预PCR工作。此外，已被引入后PCR室消耗品和PPE（实验服，手套，护目镜等）不应该被放在不彻底去污在预PCR室回来。包含PCR扩增子废旧物资不应该被允许积聚在一个区域靠近参与模板分离和纯化人员。

专用设备和耗材
除了分离的空间外，所有的供应和设备，如离心机，储物冰箱/冰箱，踩液体，试剂，踩液体尖端，机架等都应专用于每个区域，不应在区域之间互换。此外，操作员的实验室外套应分开专用于三个区域。

PCR实验室运作

表面和设备消毒
通过使用70％的乙醇，以清洁的工作表面和设备之前和之后，污染可以被减小。经常使用新鲜制备的10％-15％的次氯酸钠以清洁表面和擦拭用去离子水之前等待10至15分钟。替代地，如果次氯酸钠是不适合用于净化设备的金属部分被验证为DNA破坏性表面净化剂可商购获得的产品都可以使用。如果使用70％的乙醇代替的次氯酸钠，将需要用UV光照射，以完成去污。

UV光
在使用之前，层流柜或生物安全柜应当使用UV光进行净化为至少半小时，并用70％乙醇清洗。在所有的遮光罩气流和高效过滤应监测和认证按照制造商的建议。经常暴露于紫外光通宵工作领域和空间。

使用气溶胶屏障提示
气溶胶可以导致来自样品的交叉污染样品。气溶胶屏障移液管提示可以防止将少量污染雾化样品的重新引入污水渗透到下一个被移液的样品中。此外，正确的移液技术还有助于减少污染。在分配液体时可能导致液体和产生气溶胶的产生时可能导致溅起。

小心打开和关闭样品管
应非常小心地打开和关闭所有样品管和反应板，以确保液体不会溅出。打开前旋转管/板可防止打开时出现气溶胶。

每个PCR实验都有设置控制
包括良好的，确认的正和阴性对照，以及所有反应中的无模板控制（NTC）。阳性控制不应浓度非常高，因为它带来了污染风险。NTC用于检查试剂，耗材和环境中是否存在污染。

尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）/尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）
对于dTTP的取代使用UDG / UNG和的dUTP可有助于从先前的PCR反应除去遗留的扩增污染。该UDG / UNG方法效果最好的T-丰富的扩增产物，是不是有效，与富含GC的扩增产物。UDG / UNG不能有效DNA污染的来源，比从以前的qPCR实验含有的dUTP扩增产物等。

结论
本文列举了一些常用的方法，以减少PCR实验室或避免污染，供大家参考。你可以参考上面的提示，并与当地的指导和良好实验室规范，以防止污染的发生，将它们结合起来。

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参考：
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2。分子测试的DOS和注意事项。世界卫生组织：全球疟疾计划。

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