要点

• 革兰氏+ve，非致病性，嗜热嗜酸孢子形成细菌
• 脂环杆菌果汁中微生物腐败的原因是什么
• 在较宽的温度和pH范围内进行有氧生长
• 可能会导致饮料中的异味，由于不产生气体，变质可能不明显
• IFU试验方法脂环杆菌于2019年5月修订(见修订IFU方法)
• 脂环杆菌也被称为嗜热嗜酸细菌(TAB)

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介绍Alicyclobacillus
脂环杆菌仕达屋优先计划．是饮料行业中不寻常且潜在重要的腐败细菌。直到最近，由于pH值较低，只有酵母菌、霉菌和少数乳酸菌被认为能够腐败基于果汁或含有果汁的饮料。

但在1984年，德国报道了耐热细菌对环境稳定的无菌包装苹果汁的大规模腐败。这是第一次有记录的由现在被称为脂环杆菌．从那时起，类似的腐败现象在世界各地都被广泛报道。这些细菌可能是一个严重的问题，因为有些菌株能够在水果饮料中产生一种独特而强大的化学污染，一旦出现在加工环境中，它们就很难控制。

因此，获得灵敏的检测测试对于筛选原料和成品，以确保它们不含脂环杆菌许多基于传统和快速技术的方法已经开发出来以满足这一需求。

历史脂环杆菌

能够在高温和低pH值下生长的孢子形成细菌于1967年首次从日本的温泉中分离出来。这些嗜热嗜酸物种最初被归类为芽孢杆菌coagulans，但从美国火山泉中分离出的类似的分离株则被归类为一个新种并被命名芽孢杆菌acidocaldarius．

后来还发现了其他一些物种，包括从德国腐烂的苹果汁中分离出来的物种，随后被命名芽孢杆菌acidoterrestris．但进一步的基因研究表明，这些细菌实际上与其他细菌有很大的不同芽孢杆菌1992年为属脂环杆菌被提议作为他们的一个合适的家。大约20种脂酰钴杆菌现已被确认。

Alicyclobacillus”表型

脂环杆菌属，是革兰氏阳性、非致病性、嗜热和嗜酸性孢子形成细菌，发现于酸性温泉和土壤中。它们是有氧的，据报道可以在很宽的温度范围内生长（4-70℃）^oC)和pH值(0.5 - 6.5)，尽管从变质的水果饮料中分离出来的菌株通常不会在非常低的温度或极端酸性条件下生长。

孢子相对耐热，能够在通常用于果汁和其他货架稳定饮料的巴氏杀菌处理中存活。人们认为巴氏杀菌的“热休克”实际上可能促进孢子萌发。这些细菌在果汁酸性条件下生长的能力意味着至少，它们可能会在成品包装中成倍增加脂环杆菌物种似乎是相当普遍的水果产品，可能是由于土壤污染，他们的存在并不总是导致腐败。但如果出现这种情况，对饮料制造商来说就会是一个严重且代价高昂的问题。

脂环杆菌腐败

腐败通常不明显，因为不产生气体，并且在产品到达市场和收到消费者投诉之前可能未被发现。不幸的是，一些分离物产生强大的污染化合物作为次级代谢物，这些物质具有独特的味道和气味，通常被描述为防腐剂、药物或酚类物质。最常见的污染化合物是愈创木酚，但在变质饮料中也发现了卤代酚，如2,6-二溴苯酚。

大量的脂环杆菌在可检测到的损坏发生之前，并不总是必要的。数字低至10⁴在变质样品中发现CFU/ml，在环境温度下可以生长。最常与腐败联系在一起的物种是A.酸乳杆菌但是发霉，A.acidocaldarius和嗜酸杆菌也会产生污染化合物，偶尔也会从变质产品中分离出来。据报道，一系列饮料产品会变质，包括各种果汁和混合果汁产品、碳酸果汁饮料、冰茶和水果调味水，以及罐装番茄。

培养的方法脂环杆菌测试

不引人注目的性质脂环杆菌饮料的增长可能导致大规模的腐败事件，给饮料制造商带来严重后果。这意味着在生产过程中对生物体的控制是必不可少的，但孢子的耐热性决定了这并不容易实现。筛选成分，尤其是果汁，以获得活菌脂环杆菌因此，孢子成为防止腐败的关键工具之一。从质量保证的角度来看，对成品的定期监控同样重要，以确保控制是有效的，并在早期阶段发现潜在的损坏。这些要求推动了基于传统文化技术和快速技术的一系列方法的发展。

脂环杆菌侦查

脂环杆菌非选择性固体培养基通常用于测定食品和饮料中的总活菌数，在非选择性固体培养基上，物种不能生长良好。作为嗜酸菌，它们需要还原pH环境(pH≤4.0)。许多不同的媒体已经被采用，或专门开发来检测和/或列举脂环杆菌，包括橙色血清琼脂（OSA）、酸化马铃薯葡萄糖琼脂、K琼脂、YSG琼脂和嗜酸杆菌介质（BAT）。主要由饮料行业开发了基于这些的各种方法，用于质量保证目的，并且市场上可以买到合适的介质。大多数方法主要用于检测A.酸乳杆菌. 人们还试图制定标准的方法协议，尽管目前还没有普遍接受的方法，但国际果汁生产商联合会（IFU）第12号方法被广泛使用。IFU方法12包括检查原材料的程序，包括工艺用水、加工后立即取样的最终产品和从市场上获取的最终产品，以调查可能的变质。你可以在纽约电视台上看一个简短的11分钟的演讲IFU方法。12:2019默克公司Andreas Bubert博士

脂环杆菌在原材料

孢子在原材料中最受关注，IFU方法包括对样品进行热休克处理（通常相当于80℃10分钟），以促进孢子萌发。然后将样品直接镀到BAT琼脂或其他合适的培养基上，并在45℃下培养3-5天。任何可见的殖民地都是假定的脂环杆菌物种。如果孢子数量少是一个问题，样品可以在BAT培养液中45℃富集2-4天，或者在可过滤样品的情况下，在镀出前通过膜过滤浓缩。

测试脂环杆菌加工后的成品中

同样，该方法旨在检测孢子，但巴氏杀菌后不认为有必要立即进行热休克。由于可能存在少量孢子，因此建议在样品取样前进行膜过滤、成品在最终包装中在45℃下预培养7天或在蝙蝠肉汤中富集重新镀到固体介质上。

测试脂环杆菌在分销链的成品中

样品可以在45℃下预孵育7天，也可以采用可选的热冲击处理和浓缩程序。但如果怀疑变质，则可行脂环杆菌营养细胞可通过直接电镀检测到。

确认和识别脂环杆菌

选择性介质的增长可以被认为是一种假定的识别脂环杆菌，但传统的确认测试可能不可靠。一种常用的方法是测试愈创木酚生产的菌落，因为该化合物的特点是通过天敌．该方法以香兰素为原料，在液体培养基中培养，并通过过氧化物酶比色法(PECA)检测，在培养基中产生棕色的复合物。A.酸乳杆菌可与A.acidocaldarius在30、45和65℃下培养。A.酸乳杆菌在65摄氏度时不会生长A.acidocaldarius在30℃时不会生长

快速检测方法脂环杆菌

常规培养方法需要10-12天才能检测到脂环杆菌并在24小时内确认分离株生产愈创木酚。鉴定分离菌株可能需要更长的时间。因此，研究工作的目的是减少取得成果所需的时间，这是不足为奇的。许多快速技术已经被研究和一些测试已经发展成饮料工业的商业产品。

检测脂环杆菌

流式细胞术已广泛应用于饮料中测定总活菌数和酵母菌的检测，但其用途仅限于脂环杆菌检测也进行了调查。这项技术依赖于对活细胞进行荧光标记，然后用激光检测活细胞。流式细胞术不是特别敏感，至少需要10^3.检测所需的每毫升细胞数。这意味着仍然需要一个耗时的预培养或浓缩步骤，但培养细菌所需的3-5天可缩短至约10小时。已开发出分子生物学方法用于快速检测细菌脂环杆菌．

基于聚合酶链反应的检测方法已经得到了广泛的研究，并且有一些商业测试试剂盒可用。BioTECON已经开发了foodproof®脂环杆菌检测试剂盒，可与食品样品制备试剂盒配合使用，进行实时PCR检测脂环杆菌物种。检测下限为每毫升100个细胞左右，但该方法无法检测到孢子，因此仍然需要进行预培养或富集，以使孢子萌发和营养细胞增殖，但只需要48小时，而不是5-7天。检测需要几个小时，测试套件也能够识别A.酸乳杆菌从物种水平来看。

Pall已将GeneDisc®PCR解决方案商业化，用于脂环杆菌两天后进行spp检测。该检测试剂盒还提供主要腐败相关菌株的鉴定。2小时的方案可用于快速量化脂环杆菌在生产流程的关键点实现早期过程控制。该方案的定量限为100个目标细菌/样本。

基因探针技术也被用于检测脂环杆菌并已开发成Sysmex VIT形状的商业产品-脂环杆菌检测试验。该试验可直接应用于浓缩培养物和短时间（48小时）预培养后的样品，但无需提取DNA。它使用荧光标记的特异基因探针，在短潜伏期内与细菌细胞内的rRNA结合。然后通过荧光显微镜检查样本，以检测和分化活细胞脂环杆菌的物种,A.酸乳杆菌．测试在3小时内产生结果。

的识别脂环杆菌

确认推定的困难脂环杆菌通过常规技术对样品进行检测和鉴定分离菌株导致了对替代方法的研究。傅立叶变换红外光谱(FT-IR)已被用于分析细菌细胞壁和细胞膜的成分，并已证明能够区分脂环杆菌物种和其他细菌的培养。FT-IR还能区分不同的菌株A.酸乳杆菌鉴定产愈创木酚的菌株。

分子方法在鉴定细菌方面显示出良好的前景脂环杆菌物种。例如，已经研究了16S和23S rRNA编码基因的DNA核型，发现可以识别许多分离株。DNA测序也已成功应用，测序技术的快速发展可能很快使其成为一种更实用、更便宜的鉴定技术。设计用于分析整个细菌基因组的微阵列已经开发出来，不仅能够识别不同的物种和菌株，而且还能够识别特定特征的标记，如愈创木酚的生产。

修订IFU方法12:2019

2019年5月，修订的简化试验方法脂环杆菌由国际果蔬协会IFU出版。IFU方法第12号:2019描述了芽孢形成的嗜热嗜酸腐败菌的检测和计数，即脂环杆菌. 适用于检测果汁、果汁相关产品和成分、环境样品（如工艺用水）和一些非果汁饮料（如糖浆）。观看解说员视频在这里．

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